Analysemethoden

Die Array-CGH (Array-Comparative-Genomic-Hybridization) stellt eine neue Technik zur hochauflösenden molekularen Karyotypisierung dar. Diese ermöglicht mittels vergleichender genomischer Hybridisierung auch den Nachweis kleinerer genomischer Imbalancen, die in der konventionellen Chromosomenanalyse bisher nicht detektierbar waren.

Ein klassischer Einsatzbereich der Array-CGH sind beispielsweise Kinder mit mentaler Retardierung und/oder Organfehlbildungen und Dysmorphien, bei denen kein konkreter Syndromverdacht besteht, die aber in der konventionellen Chromosomenanalyse unauffällig waren. Weiterhin ist eine Array-CGH bei solchen Kindern indiziert, bei denen ein genereller Verdacht auf das Vorliegen eines Mikrodeletionssyndroms besteht, eine genauere Spezifizierung aber nicht möglich ist und verschiedene Syndrome mit dieser Untersuchung abgeklärt werden sollen. Zudem kommt diese Untersuchungsmethode bei Patienten mit dem dringenden Verdacht auf eine monogenetische Erkrankung in Frage, bei denen die vorangehende molekulargenetische Untersuchung unauffällig war.

Bei der Array-CGH wird das gesamte Genom eines Patienten mit dem genetischen Material einer unauffälligen Referenzprobe verglichen. Hierzu werden die beiden DNA-Proben mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markiert, im gleichen Verhältnis gemischt und auf einem „Array“ kohybridisiert. Bei dem Array handelt es sich um einen Objektträger, auf dem sich tausende von immobilisierten DNA-Fragmenten (zumeist Oligonukleotide) in sehr hoher Dichte befinden. Diese DNA-Sonden hybridisieren mit dem markierten DNA-Gemisch, dabei konkurrieren Patienten- und Referenz-DNA um die Bindungsstellen. Eine computergestützte Bearbeitung der Fluoreszenzsignale ermöglicht im Patientengenom,  im Vergleich zur Referenzprobe, den Nachweis genomischer Imbalancen (Deletionen/Duplikationen). Methodisch bedingt können balancierte Strukturaberrationen mit dieser Methode nicht erfasst werden.

Die Ermittlung der DNA-Sequenzabfolge eines PCR-Produktes wird standardmäßig mittels der „Sanger-Sequenzierung“ durchgeführt. Hierbei werden die Produkte der „Sequenzierungs-Kettenabbruchreaktion“ in einer denaturierenden Kapillarelektrophorese auf Sequenzierungsautomaten aufgetrennt und mittels Fluoreszenzfarbstoffen nachgewiesen.

Vorteil: Schnelle und robuste Darstellung der DNA-Sequenzabfolge von PCR-Produkten.

Nachteil: Aufwändig bei großen Genen, da jedes PCR-Produktseparat bearbeitet werden muss und Sensitivität von Mosaikbefunden (ca. 15-20%).

Strukturelle Veränderungen mit konventionellen Färbemethoden können nur dann nachgewiesen werden, wenn sie eine bestimmte Größe (ca. 5 Mb) nicht unterschreiten. Mit Hilfe der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) kann diese Auflösungsgrenze auf ca. 0,1 Mb gesteigert werden. Dabei werden mit Fluorochromen markierte DNA-Sonden verwendet, die unterschiedlich grosse Bereiche des Genoms abdecken.

Paint-Sonden (whole chromosome (WCP) und chromosome arm-specific) dienen zum Nachweis von Translokationen und Markerchromosomen an kultiviertem Probenmaterial.

Regionen-spezifische Sonden weisen Sequenzen definierter Chromosomenbereiche an kultiviertem Probenmaterial nach (z.B. LSI (locus-specific identifier) und CEP (chromosome enumeration probe).

Subtelomer-Sonden, die für einen bestimmten Chromosomenarm (p/q) spezifisch sind, dienen dem Nachweis von kryptischen terminalen Deletionen (Subtelomer-FISH).

Multicolour-FISH (M-FISH) ist ein Verfahren, das alle 24 verschiedenen Chromosomen des Menschen in einer einzigen Hybridisierung durch ihr spezifisches Farbmuster identifizieren kann.

Diese Methode wird für Fragestellungen in der Tumorzytogenetik, zur Identifizierung von Markerchromosomen und zur Charakterisierung von Umbauten, die mit den konventionellen Färbetechniken nicht nachweisbar sind, eingesetzt.

Die Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) ist eine hochauflösende Methode zur gleichzeitigen, semiquantitativen Analyse von bis zu 50 Nukleinsäurefragmenten in einem Ansatz. Mit ihr lassen sich anhand kleinster DNA-Mengen Dosisunterschiede an einem zuvor definierten Ort im Genom nachweisen. Dazu zählen Kopienzahlveränderungen, Deletionen/Duplikationen einzelner Genabschnitte (Exons), bzw. ganzer Gene, als auch spezifische Mutationen. Die Amplifikationsprodukte werden durch Kapillarelektrophorese der Größe nach getrennt. Durch einen Vergleich des Patienten mit normalen Kontrollpersonen können Dosisunterschiede, Reduktion, Zunahme der Peakhöhen/Peakflächen erkannt werden.

Das „Next-Generation-Sequencing“ ermöglicht  mittels „massiver multipler paralleler Sequenzierung“ die Analyse von bis zu mehreren Millionen DNA-Einzelmolekülen in einem Sequenzierungslauf. Die Sequenzierung der Einzelmoleküle findet entweder an PCR-Produkten (sog. Amplicon-Libraries) oder an spezifisch präparierten DNA-Fragmenten (sog. Enrichment-Libraries) statt.

Im Gegensatz zur Sanger-Sequenzierung erfolgt per NGS-Technologie der Nachweis einer cis- oder trans-Lokalisation von Varianten, sofern sie räumlich eng benachbart vorkommen (<300bp). Auch ist die Detektionsgrenze für Mosaike (<5%) deutlich erhöht.

Auf Grund der großen Anzahl von untersuchten Genen in den Multigen-Analysen steigt auch der Aufwand für die bioinformatische Auswertung der Sequenzinformationen. Durchschnittlich werden pro analysiertes Gen ca. 4-6 Sequenzvarianten (Small Nucleotide Variants (SNVs)) nachgewiesen, deren Relevanz für die Befundinterprätation mittels unterschiedlicher Datenbanken beurteilt werden muss. 

Next-Generation-Sequencing-Diagnostik

•    Die Anreicherung spezifischer Regionen des Genoms erfolgt mit Twist Bioscience Enrichment oder illumina TruSight Kits. Die paired-end Sequenzierung wird auf einem NovaSeq6000, NextSeq 500 oder MiSeq illuminaR Analyzer durchgeführt.

•    Analysiert werden die kodierenden Exons sowie die Exon-Intron Übergänge (+/- 20 bp) hinsichtlich Punktmutationen und kleiner Insertionen/Deletionen (bis ca. 50 bp).

•    Der Befund enthält eine ausführliche Interpretation der identifizierten Varianten durch biomedizinische Experten und Fachärzte für Humangenetik. Zusätzlich werden im Befund die analysierten Bereiche, deren Abdeckung, sowie weitere Daten zur Qualität der Analyse angegeben. Zur Qualitätssicherung erfolgt eine Identitätsbestätigung der NGS-Proben mit Hilfe einer zweiten unabhängigen SNP-Methode.
 

Qualitätskriterien der NGS Analyse

•    Eine mittlere Sequenzierungsqualität (Q-phred Score) größer 30 pro Sequenzierzyklus (entspricht einer 99,9% -igen Detektionsgenauigkeit).

•    Eine Sequenziertiefe von über 20 Reads pro Base in mindestens 98% der untersuchten Bereiche. Bereiche, die mit einer niedrigeren Readanzahl abgedeckt sind, können nur mit eingeschränkter Aussagekaraft bewertet werden. Aktuell liegt die Minimalzahl für homozygote Calls bei 6 Reads und für heterozygote Calls bei 13 Reads.

•    Die NGS Panels werden nach aktuellen NGS Diagnostik Richtlinien (s.o) validiert, um eine ausreichende Qualitätssicherung für die Bewertung zu garantieren.

•    Parallel zur NGS Analyse wird bei jedem Patienten der Genotyp an 34 polymorphen Loci bestimmt, um eine Kontamination und/oder Probenvertauschung im Laufe der NGS-Analyse auszuschließen.

Qualitätsstufen in der NGS-Diagnostik

Für die NGS-Analysen werden je nach klinischer Fragestellung und technischer Realisierbarkeit unterschiedliche Qualitätsstufen der diagnostischen Sequenziertiefe (Qualitätsstufen A-C) angewendet (Siehe "S1-Leitlinie: Molekulargenetische Diagnostik mit Hochdurchsatz-Verfahren, beispielsweise mit Next-Generation Sequencing" und "Guidelines for diagnostic next-generation sequencing" (Matthijs et al., Eur J Hum Genet. 2016 Jan;24(1):2-5)).

Typ A-Test

Höchster mittels NGS erreichbarer Qualitätsstandard. Alle Zielregionen der kodierenden und flankierenden intronischen Bereiche (+/- 20 bp) der Gene sind mit ausreichender Sequenziertiefe (Reads 20-fach) abgedeckt. Die Diagnostik wird in problematischen Bereichen mit einer ergänzenden Sangersequenzierung und z.B. Long-Range PCR ergänzt. Typ A-Tests eignen sich auch zum Diagnose-Ausschluss.

Typ B-Test

Bei größeren Panels (>50 Gene) können oftmals nicht die optimalen Qualitätswerte erreicht werden. Hier werden die Core-Gene vollständig abgedeckt und ggfs. mit Sanger-Sequenzierung ergänzt. Die Information, welche Bereiche individuell unzureichend abgedeckt sind, wird in einer Tabelle dargestellt. Typ B-Tests eignen sich vornehmlich zur Bestätigung von Verdachtsdiagnosen und nicht immer für eine Ausschlussdiagnostik.

Typ C-Test

Hier werden ausschließlich die mittels NGS generierten Daten verwendet und eventuell vorhandene Lücken werden nicht geschlossen. Aufgrund der großen Anzahl untersuchter Gene (z.B. WES) können auch keine Core-Gene definiert werden.

Die Einteilung in Typ A-, B- und C-Tests bezieht sich ausschließlich auf Sequenziertechnologien. Je nach Erkrankung und Indikationsgruppe kann es nötig sein, andere Analyseverfahren wie MLPA, Long Range PCR und Repeat-PCR zusätzlich zur Diagnostik zu verwenden.
 

„Core“-Gene in der humangenetischen Diagnostik

„Core“-Gene beziehen sich auf die wichtigsten Symptome und umfassen alle erforderlichen Gene, die zwingend bei der diagnostischen Abklärung untersucht und beurteilt werden sollen.

Die SNP-Array Technologie (Single-Nucleotide-Polymorphism-Array) stellt eine hochauflösende, molekulare Karyotypisierung dar, welche mittels genomischer Hybridisierung dem Nachweis genomischer Imbalancen (Kopienzahlvariationen, CNV) dient. Methodenbedingt können hierbei balancierte Aberrationen nicht erfasst werden.

Die Microarray-Technologie von Illumina (auch bekannt als BeadArray-Technologie) verwendet Siliziumdioxid-Mikroperlen. Auf der Oberfläche jedes Arrays (BeadChips) können Hunderttausende, bis Millionen von Genotypen für ein einzelnes Individuum auf einmal getestet werden. Auf GSA-cyto+ Arrays sind ca. 700.000 spezifische Sonden auf einem Sub-Array vorhanden. Winzige Silikaperlen, in Mikrovertiefungen untergebrachtund mit mehreren Kopien einer Oligonukleotidsonde beschichtet, zielen auf einen bestimmten Ort im Genom ab.

Wenn DNA-Fragmente eines Patienten den BeadChip passieren, bindet jede Sonde an eine komplementäre Sequenz in der Proben-DNA und stoppt eine Base vor dem interessierenden Locus. Die Allelspezifität wird durch eine einzelne Basenerweiterung erzielt, die eines von vier markierten Nukleotiden enthält. Bei Anregung durch einen Laser sendet die Nukleotidmarkierung ein Fluoreszens-Signal aus. Die Intensität dieses Signals vermittelt die Information über das Allelverhältnis an diesem Locus. Ein im Vergleich zum Durchschnitt erhöhtes Signal steht für einen Zugewinn (copy gain / Duplikation); ein im Vergleich zum Durchschnitt erniedrigtes Signal steht für einen Verlust (copy loss / Deletion). Nach Daten-Extraktion und Bestimmung der Qualitätsparameter erfolgt die eigentliche Auswertung mit Hilfe eines geeigneten Programms (NxClinical).

Die Real-Time PCR kann in der Diagnostik für verschiedene Fragestellungen herangezogen werden. Hierbei werden die PCR-Produkte unter Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen bereits während der PCR-Reaktion detektiert. Die Daten können anschließend z.B. für eine Quantifizierung (Kopienzahlermittlung, Erregernachweis) oder für eine Ermittlung der DNA-Sequenz (SNP-Nachweis) verwendet werden.