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Analysemethoden

Im folgenden Bereich haben wir für Sie alle wichtigen Analysemethoden zusammengestellt.


Die Array-CGH (Array-Comparative-Genomic-Hybridization) stellt eine neue Technik zur hochauflösenden molekularen Karyotypisierung dar. Diese ermöglicht mittels vergleichender genomischer Hybridisierung auch den Nachweis kleinerer genomischer Imbalancen, die in der konventionellen Chromosomenanalyse bisher nicht detektierbar waren.

Ein klassischer Einsatzbereich der Array-CGH sind beispielsweise Kinder mit mentaler Retardierung und/oder Organfehlbildungen und Dysmorphien, bei denen kein konkreter Syndromverdacht besteht, die aber in der konventionellen Chromosomenanalyse unauffällig waren. Weiterhin ist eine Array-CGH bei solchen Kindern indiziert, bei denen ein genereller Verdacht auf das Vorliegen eines Mikrodeletionssyndroms besteht, eine genauere Spezifizierung aber nicht möglich ist und verschiedene Syndrome mit dieser Untersuchung abgeklärt werden sollen. Zudem kommt diese Untersuchungsmethode bei Patienten mit dem dringenden Verdacht auf eine monogenetische Erkrankung in Frage, bei denen die vorangehende molekulargenetische Untersuchung unauffällig war.

Bei der Array-CGH wird das gesamte Genom eines Patienten mit dem genetischen Material einer unauffälligen Referenzprobe verglichen. Hierzu werden die beiden DNA-Proben mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markiert, im gleichen Verhältnis gemischt und auf einem „Array“ kohybridisiert. Bei dem Array handelt es sich um einen Objektträger, auf dem sich tausende von immobilisierten DNA-Fragmenten (zumeist Oligonukleotide) in sehr hoher Dichte befinden. Diese DNA-Sonden hybridisieren mit dem markierten DNA-Gemisch, dabei konkurrieren Patienten- und Referenz-DNA um die Bindungsstellen. Eine computergestützte Bearbeitung der Fluoreszenzsignale ermöglicht im Patientengenom,  im Vergleich zur Referenzprobe, den Nachweis genomischer Imbalancen (Deletionen/Duplikationen). Methodisch bedingt können balancierte Strukturaberrationen mit dieser Methode nicht erfasst werden.


Die Ermittlung der DNA-Sequenzabfolge eines PCR-Produktes wird standardmäßig mittels der „Sanger-Sequenzierung“ durchgeführt. Hierbei werden die Produkte der „Sequenzierungs-Kettenabbruchreaktion“ in einer denaturierenden Kapillarelektrophorese auf Sequenzierungsautomaten aufgetrennt und mittels Fluoreszenzfarbstoffen nachgewiesen.

Vorteil: Schnelle und robuste Darstellung der DNA-Sequenzabfolge von PCR-Produkten.

Nachteil: Aufwändig bei großen Genen, da jedes PCR-Produktseparat bearbeitet werden muss und Sensitivität von Mosaikbefunden (ca. 15-20%).


Strukturelle Veränderungen mit konventionellen Färbemethoden können nur dann nachgewiesen werden, wenn sie eine bestimmte Größe (ca. 5 Mb) nicht unterschreiten. Mit Hilfe der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) kann diese Auflösungsgrenze auf ca. 0,1 Mb gesteigert werden. Dabei werden mit Fluorochromen markierte DNA-Sonden verwendet, die unterschiedlich grosse Bereiche des Genoms abdecken.

  • Paint-Sonden (whole chromosome (WCP) und chromosome arm-specific) dienen zum Nachweis von Translokationen und Markerchromosomen an kultiviertem Probenmaterial.
  • Regionen-spezifische Sonden weisen Sequenzen definierter Chromosomenbereiche an kultiviertem Probenmaterial nach (z.B. LSI (locus-specific identifier) und CEP (chromosome enumeration probe).
  • Subtelomer-Sonden, die für einen bestimmten Chromosomenarm (p/q) spezifisch sind, dienen dem Nachweis von kryptischen terminalen Deletionen (Subtelomer-FISH).
  • Multicolour-FISH (M-FISH) ist ein Verfahren, das alle 24 verschiedenen Chromosomen des Menschen in einer einzigen Hybridisierung durch ihr spezifisches Farbmuster identifizieren kann.

Diese Methode wird für Fragestellungen in der Tumorzytogenetik, zur Identifizierung von Markerchromosomen und zur Charakterisierung von Umbauten, die mit den konventionellen Färbetechniken nicht nachweisbar sind, eingesetzt.


Die Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) ist eine hochauflösende Methode zur gleichzeitigen, semiquantitativen Analyse von bis zu 50 Nukleinsäurefragmenten in einem Ansatz. Mit ihr lassen sich anhand kleinster DNA-Mengen Dosisunterschiede an einem zuvor definierten Ort im Genom nachweisen. Dazu zählen Kopienzahlveränderungen, Deletionen/Duplikationen einzelner Genabschnitte (Exons), bzw. ganzer Gene, als auch spezifische Mutationen. Die Amplifikationsprodukte werden durch Kapillarelektrophorese der Größe nach getrennt. Durch einen Vergleich des Patienten mit normalen Kontrollpersonen können Dosisunterschiede, Reduktion, Zunahme der Peakhöhen/Peakflächen erkannt werden.


Das „Next-Generation-Sequencing“ ermöglicht  mittels „massiver multipler paralleler Sequenzierung“ die Analyse von bis zu mehreren Millionen DNA-Einzelmolekülen in einem Sequenzierungslauf. Die Sequenzierung der Einzelmoleküle findet entweder an PCR-Produkten (sog. Amplicon-Libraries) oder an spezifisch präparierten DNA-Fragmenten (sog. Enrichment-Libraries) statt.

Im Gegensatz zur Sanger-Sequenzierung erfolgt per NGS-Technologie der Nachweis einer cis- oder trans-Lokalisation von Varianten, sofern sie räumlich eng benachbart vorkommen (<300bp). Auch ist die Detektionsgrenze für Mosaike (<5%) deutlich erhöht.

Auf Grund der großen Anzahl von untersuchten Genen in den Multigen-Analysen steigt auch der Aufwand für die bioinformatische Auswertung der Sequenzinformationen. Durchschnittlich werden pro analysiertes Gen ca. 4-6 Sequenzvarianten (Small Nucleotide Variants (SNVs)) nachgewiesen, deren Relevanz für die Befundinterprätation mittels unterschiedlicher Datenbanken beurteilt werden muss. 


Die Real-Time PCR kann in der Diagnostik für verschiedene Fragestellungen herangezogen werden. Hierbei werden die PCR-Produkte unter Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen bereits während der PCR-Reaktion detektiert. Die Daten können anschließend z.B. für eine Quantifizierung (Kopienzahlermittlung, Erregernachweis) oder für eine Ermittlung der DNA-Sequenz (SNP-Nachweis) verwendet werden.